Người chơi sẽ điều khiển Leon S. Kennedy từ một góc nhìn người thứ ba trong suốt trò chơi, với nhiệm vụ phải cứu thoát cô con gái của Tổng thống Mỹ là Ashley Graham. Trò chơi tập trung vào những hành động và dùng súng để tiêu diệt các nhóm kẻ thù trong những khu vực rộng lớn. Góc nhìn của người chơi là ở phía sau Leon nhìn tới trước, và nhìn qua vai Leon khi nhắm súng. Ánh laser mới được thêm vào cho phép người chơi nhắm được chính xác hơn và dễ dàng thay đổi hướng nhắm nếu đối phương chuyển động. Những phát đạn cũng cho hiệu quả thực tế hơn: khi bắn vào chân thì đối phương sẽ vấp ngã, còn khi bắn vào tay sẽ khiến chúng đánh rơi vũ khí.

Một trong những thay đổi mới ở Resident Evil 4 đó là điều khiển nhân vật theo ngữ cảnh. Trong các tình huống cụ thể, người chơi có thể tương tác với môi trường xung quanh: đá ngã cầu thang xuống, nhảy ra khỏi cửa sổ hoặc né đòn tấn công của đối phương. Đôi lúc trong trò chơi có các đoạn cắt cảnh tương tác, khi đó người chơi phải nhấn đúng những nút hiển thị trên màn hình để nhân vật thực hiện hành động tương ứng, như là né tránh một tảng đá rơi xuống hoặc một kẻ thù tấn công. Những đoạn cắt cảnh này thường được lồng trong các trận đấu trùm, khi mà người chơi phải tránh các đòn tấn công thật lực của đối phương để tránh bị tiêu diệt.

Đối thủ chính của người chơi là Los Ganados ("con thú" - tiếng Tây Ban Nha) - những con người đã bị nhiễm ký sinh trùng Las Plagas ("Dịch bệnh" - tiếng Tây Ban Nha). Chúng khôn lanh và nhanh nhẹn hơn so với những phiên bản trước của trò chơi. Chúng có thể né đòn tấn công của người chơi, có thể sử dụng nhiều loại vũ khí, thậm chí chúng còn có thể tấn công đồng loạt và giao tiếp với nhau.

Những vật dụng mà người chơi nhặt (hoặc mua) được được đựng trong một chiếc cặp. Chiếc cặp này có thể được nâng cấp nhiều lần, mỗi lần chiếc cặp sẽ to hơn, chứa được nhiều vật dụng hơn. Súng, đạn và những vật dụng giúp hồi máu sẽ được đặt trong cặp, còn các chìa khóa được đặt trong một danh mục riêng. Đôi lúc trong trò chơi sẽ xuất hiện một người lái buôn tại những địa điểm nhất định. Người này bán thuốc xịt hồi máu (First Aid Spray), súng, nâng cấp súng và mua lại những thứ quý giá mà Leon tìm được. Các loại vũ khí có các ưu điểm và khuyết điểm riêng.[4][5] Một mục tiêu của việc thiết kế trò chơi đó là tạo ra sự đa dạng cho vũ khí, nhờ đó làm tăng tính tự do và chiều sâu trò chơi cho người chơi.[6]

Capcom đã thêm nhiều nội dung mới vào phiên bản cho PlayStation 2, sau đó là vào phiên bản cho máy tính để bàn và Wii. Nội dung mới quan trọng nhất là phần chơi "Separate Ways", một phần chơi nhỏ xoay quanh sự liên quan của Ada Wong đến từng thời điểm của trò chơi và mối quan hệ của cô này với Albert Wesker, một cựu thành viên của STARS, người đang có tham vọng hồi sinh Umbrella. "Ada's Report" (Bản báo cáo của Ada), một tài liệu gồm năm phần, cho thấy quan hệ của Ada với Wesker và vai trò của Wesker trong âm mưu này. Phần nội dung khác gồm "The Mercenaries", "Assignment Ada" - có trong tất cả các phiên bản, là một phần chơi nhỏ, qua đó người chơi vào vai Ada để thu hồi các mẫu thử plaga, trang phục mới cho Leon và Ashley, những vũ khí mới được mở và một Trình xem phim (Movie Browser).